Plásmido CRISPR de Activación (h) ANKFY1: sc-406658-ACT

El gen humano **ANKFY1** (ankyrin repeat and FYVE domain containing 1) codifica un adaptador asociado a membrana implicado en el tráfico endosomal y en la dinámica del endosoma temprano dependiente de Rab5 mediante la interacción de su dominio FYVE con el fosfatidilinositol 3‑fosfato. Al coordinar la clasificación de carga, el reciclaje de receptores y la maduración del endosoma, ANKFY1 contribuye a la regulación de las respuestas de señalización procedentes de receptores internalizados y puede influir en vías de homeostasis celular relacionadas con la detección de factores de crecimiento y nutrientes. El transporte endocítico desregulado es una característica recurrente en la biología del cáncer y la neurodegeneración, lo que convierte a ANKFY1 en un nodo relevante para estudios mecanísticos sobre señalización mediada por vesículas y proteostasis. Su arquitectura de dominios también permite investigar la unión a fosfoinosítidos, las interacciones proteína‑proteína mediadas por repeticiones de anquirina y la regulación específica por compartimento de los complejos de tráfico.

ANKFY1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ANKFY1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ANKFY1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ANKFY1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ANKFY1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ANKFY1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ANKFY1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ANKFY1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ANKFY1 en células tumorales con expresión de ANKFY1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.