ALY Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403711-ACT

O ALYREF humano codifica a proteína ALY, um adaptador de ligação a RNA do complexo TREX que acopla o processamento co-transcricional de mRNA à exportação nuclear. A ALY coordena o recrutamento do receptor de exportação NXF1/TAP e participa de etapas associadas ao spliceossoma que garantem a maturação e o tráfego eficientes de transcritos poliadenilados, conectando transcrição, splicing e exportação. Por seus papéis no metabolismo de RNA e no controle da expressão gênica em todo o genoma, o ALYREF é frequentemente estudado em vias que regulam proliferação celular, diferenciação e respostas ao estresse. A desregulação da exportação de mRNA dependente de TREX e da expressão de ALYREF foi relatada em múltiplos contextos de câncer e em outros distúrbios com processamento de RNA alterado, o que motiva estudos mecanísticos sobre como fatores de exportação moldam transcriptomas associados a doenças.

ALY O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALYREF sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALY O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALYREF em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALYREF, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALY. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALYREF nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALY no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALY em células tumorais com expressão de ALYREF silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.