alpha Synuclein Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417273-ACT

SNCA codifica l’alfa-sinucleina umana, una proteina presinaptica coinvolta nel traffico delle vescicole sinaptiche, nel rilascio di neurotrasmettitori e nella regolazione della curvatura di membrana attraverso il legame con i lipidi. Si associa ai meccanismi di riciclo delle vescicole e influenza le vie della proteostasi, inclusi i sistemi ubiquitina–proteasoma e autofagia–lisosoma che controllano il turnover proteico e l’aggregazione. Un’espressione deregolata di SNCA o il suo misfolding sono collegati alla vulnerabilità neuronale e sono stati ampiamente studiati nel contesto della patologia dei corpi di Lewy e dei meccanismi associati alla malattia di Parkinson. In quanto modulatore dell’omeostasi sinaptica e del traffico intracellulare, SNCA è spesso utilizzato per studiare risposte allo stress, disfunzione mitocondriale e segnalazione neuroinfiammatoria in modelli cellulari.

alpha Synuclein Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SNCA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

alpha Synuclein Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SNCA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SNCA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di alpha Synuclein. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SNCA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da alpha Synuclein nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via alpha Synuclein nelle cellule tumorali con espressione di SNCA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.