AIP5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403772-ACT

WWP1 codifica per la ligasi E3 ubiquitina-proteina umana AIP5, un membro della famiglia NEDD4 di tipo HECT che regola il turnover proteico e l’ampiezza della segnalazione tramite l’ubiquitinazione dei componenti della via. Modellando il traffico dipendente dall’ubiquitina e la proteostasi, AIP5 può influenzare programmi cellulari quali la segnalazione mediata da fattori di crescita, le risposte allo stress e gli output trascrizionali. Un’attività alterata di WWP1 è stata associata a reti di segnalazione deregolate e a uno squilibrio della via dell’ubiquitina osservati in molteplici contesti patologici, rendendolo un nodo utile per studiare il riassetto delle vie di segnalazione. Nella ricerca biomedica, la modulazione dell’espressione di AIP5 aiuta a indagare come l’ubiquitinazione controlli la dinamica dei recettori, la durata del segnale e gli stati di espressione genica a valle.

AIP5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WWP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AIP5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WWP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WWP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AIP5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WWP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AIP5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AIP5 nelle cellule tumorali con espressione di WWP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.