Plasmide CRISPR d'Activation (h) β2-Adaptin: sc-402404-ACT

AP2B1 code la sous-unité humaine β2‑adaptine du complexe protéique adaptateur 2 (AP‑2), un composant central de l’endocytose médiée par la clathrine à la membrane plasmique. En couplant les motifs de reconnaissance des cargos à l’assemblage du manteau de clathrine, la β2‑adaptine favorise l’internalisation et le recyclage de récepteurs, de transporteurs et de complexes de signalisation, façonnant ainsi le trafic membranaire, le cycle des vésicules synaptiques et l’atténuation des signaux. Le trafic dépendant d’AP‑2 influence des voies telles que la signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase et des GPCR, le renouvellement des récepteurs immunitaires et l’absorption des nutriments via des décisions de tri endocytique. Le dérèglement de la fonction des adaptateurs endocytiques a été associé à des phénotypes neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques, à une altération de la fonction synaptique et, plus largement, à une vulnérabilité cellulaire accrue au stress de protéostase et de trafic.

β2-Adaptin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AP2B1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β2-Adaptin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AP2B1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AP2B1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β2-Adaptin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AP2B1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β2-Adaptin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β2-Adaptin dans les cellules tumorales présentant une expression de AP2B1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.