α_1D-AR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402904-ACT

ADRA1D codifica il recettore adrenergico umano α1D (α1D-AR), un recettore accoppiato a proteine G che si associa principalmente a Gq/11 per attivare la fosfolipasi C, aumentare il Ca2+ intracellulare e stimolare una segnalazione dipendente da PKC. Gli effetti a valle includono la modulazione delle vie MAPK/ERK e di programmi trascrizionali che regolano la contrattilità della muscolatura liscia, il tono vascolare e la neurotrasmissione autonomica. L’attività di α1D-AR influenza la fisiologia cardiovascolare e urogenitale ed è studiata nel contesto della disregolazione della segnalazione adrenergica associata a ipertensione, disfunzioni del tratto urinario inferiore e altri disturbi caratterizzati da un’alterata reattività della muscolatura liscia. L’espressione di ADRA1D e la dinamica della sua segnalazione forniscono inoltre un indicatore meccanicistico per il traffico dei GPCR, la desensibilizzazione e l’accoppiamento recettore-effettore nelle cellule umane.

α1D-AR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADRA1D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α1D-AR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADRA1D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADRA1D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α1D-AR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADRA1D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α1D-AR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α1D-AR nelle cellule tumorali con espressione di ADRA1D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.