Plasmide CRISPR d'Activation (h) ZPK: sc-404802-ACT

Le gène humain MAP3K12 code ZPK (également appelé DLK), une MAP kinase kinase kinase qui agit en amont des cascades MAPK JNK et p38 afin de réguler des programmes transcriptionnels sensibles au stress. ZPK intègre des signaux provenant de lésions axonales, de signaux inflammatoires et de perturbations du cytosquelette pour influencer la différenciation neuronale, la survie et la dégénérescence, avec des rôles marqués dans le système nerveux. Par la phosphorylation des MAP2K en aval, MAP3K12 contribue à contrôler l’apoptose, la croissance des neurites et le remodelage synaptique. Une signalisation ZPK dérégulée a été associée à la neurodégénérescence et à la biologie de la douleur neuropathique, faisant de MAP3K12 un nœud utile pour disséquer la signalisation de stress pilotée par les kinases dans des modèles de cellules humaines.

ZPK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAP3K12 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ZPK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAP3K12 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAP3K12, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ZPK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAP3K12 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ZPK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ZPK dans les cellules tumorales présentant une expression de MAP3K12 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.