Plasmide CRISPR d'Activation (h) ZnT-1: sc-403094-ACT

SLC30A1 code ZnT-1, un transporteur d’efflux du zinc principalement localisé à la membrane plasmique, qui maintient l’homéostasie du zinc cytosolique en exportant Zn2+ et en limitant la toxicité intracellulaire du zinc. En régulant les pools de zinc labile, ZnT-1 influence la signalisation dépendante des métaux, les réponses au stress oxydant et l’activité d’enzymes et de facteurs de transcription nécessitant du zinc, affectant ainsi plus largement la protéostasie et les voies d’adaptation au stress. Des altérations de la gestion du zinc et de l’expression de SLC30A1 ont été associées à la susceptibilité cellulaire à la surcharge en métaux et au déséquilibre rédox, des processus impliqués dans la neurodégénérescence, l’inflammation et des phénotypes associés au cancer. En tant que régulateur clé des flux de zinc, ZnT-1 est fréquemment étudié dans des modèles de stress métallique, d’interactions entre transporteurs et de voies reliant la disponibilité en micronutriments à la régulation génique.

ZnT-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC30A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ZnT-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC30A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC30A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ZnT-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC30A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ZnT-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ZnT-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC30A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.