Plasmide CRISPR d'Activation (h) WWOX: sc-403070-ACT

WWOX (WW domain-containing oxidoreductase) code une protéine associée à l’activité suppresseur de tumeur, localisée au niveau du site fragile commun FRA16D, et impliquée dans le maintien de la stabilité du génome. Chez l’humain, WWOX participe à des réseaux de signalisation qui intègrent l’apoptose, les réponses aux dommages de l’ADN et les voies de stress cellulaire, en partie via des interactions de son domaine WW avec des partenaires riches en proline et par la modulation de régulateurs transcriptionnels. Une expression altérée de WWOX ou une perte de fonction a été liée à la transformation oncogénique et à des phénotypes métastatiques dans de nombreux tissus ; par ailleurs, des altérations génétiques sont aussi associées à des troubles du neurodéveloppement, dont l’encéphalopathie épileptique. Ces propriétés font de WWOX une cible fréquemment étudiée dans les voies qui contrôlent la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire.

WWOX Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WWOX sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

WWOX Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WWOX dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WWOX, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de WWOX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WWOX natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de WWOX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie WWOX dans les cellules tumorales présentant une expression de WWOX silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.