Plasmide CRISPR d'Activation (h) WASP: sc-400712-ACT

Le gène humain **WAS** code la protéine du syndrome de Wiskott–Aldrich (**WASP**), un régulateur du remodelage du cytosquelette d’actine, restreint aux cellules hématopoïétiques, qui relie la signalisation proximale aux récepteurs à la nucléation de l’actine dépendante d’Arp2/3. Par ses interactions avec Cdc42, les phosphoinositides et des adaptateurs à domaine SH3, WASP coordonne la formation de la synapse immunologique, la chimiotaxie, la phagocytose et le trafic vésiculaire, modulant l’activation des lymphocytes T et B ainsi que les fonctions effectrices de l’immunité innée. L’activité de WASP intègre les signaux issus des immunorécepteurs et des intégrines afin de contrôler la dynamique du cytosquelette et les réponses transcriptionnelles au cours des réponses immunitaires. Une fonction WAS altérée est associée à une immunodéficience et à une inflammation dérégulée, faisant de WAS/WASP une cible majeure pour les études mécanistiques de la signalisation pilotée par le cytosquelette dans les cellules immunitaires humaines.

WASP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WAS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

WASP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WAS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WAS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de WASP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WAS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de WASP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie WASP dans les cellules tumorales présentant une expression de WAS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.