WAPL CRISPR Activation Plasmid (m): sc-432331-ACT

Die Maus WAPL (Wapl) kodiert einen Freisetzungsfaktor für Cohesin, der die dynamische Assoziation von Cohesin mit Chromatin reguliert und damit die höherstufige Genomorganisation sowie die Kohäsion von Schwesterchromatiden prägt. Indem WAPL während der Interphase und der mitotischen Progression das Entladen von Cohesin fördert, beeinflusst es das Timing der DNA-Replikation, die transkriptionelle Regulation und die korrekte Chromosomensegregation. Die WAPL-Aktivität greift zudem in Prozesse der DNA-Schadensantwort und -reparatur ein, indem sie die cohesinabhängige Stabilisierung gestauter Replikationsgabeln und von Reparaturfoci moduliert. Dysregulierte Cohesin-Dynamiken und eine veränderte WAPL-Expression wurden mit Genominstabilität und cohesinopathie-assoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch Wapl einen nützlichen Ansatzpunkt darstellt, um Chromatinarchitektur und Zellzykluskontrolle in krankheitsrelevanten Modellen zu untersuchen.

WAPL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Wapl-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WAPL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Wapl-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Wapl-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WAPL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Wapl-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WAPL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WAPL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Wapl-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.