Plasmide CRISPR d'Activation (h) VSTM3: sc-404147-ACT

TIGIT, également appelé VSTM3, code un immunorécepteur inhibiteur exprimé sur les lymphocytes T activés, les lymphocytes T régulateurs et les cellules NK, qui contribue au maintien de l’homéostasie immunitaire. En se liant à des ligands de la famille des récepteurs du poliovirus tels que PVR (CD155) et PVRL2 (CD112), TIGIT module une signalisation de type ITIM et contrebalance les voies co-stimulatrices, influençant la cytotoxicité, la production de cytokines et le fonctionnement de la synapse immunologique. Une altération de la signalisation de TIGIT est impliquée dans l’échappement immunitaire et le dysfonctionnement de l’immunité antitumorale, ainsi que dans des contextes d’inflammation chronique et de maladies auto-immunes, ce qui en fait un nœud central de la biologie des points de contrôle immunitaires. En tant que récepteur de surface intégrant des signaux d’adhésion et d’inhibition, TIGIT offre une porte d’entrée mécanistique pour étudier les interactions récepteur–ligand, les programmes transcriptionnels des lymphocytes épuisés et les interactions avec la signalisation CD226/DNAM-1.

VSTM3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TIGIT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VSTM3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TIGIT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TIGIT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VSTM3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TIGIT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VSTM3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VSTM3 dans les cellules tumorales présentant une expression de TIGIT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.