Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPS26B: sc-410249-ACT

VPS26B code un composant essentiel du complexe rétromère, qui contrôle le tri du cargo endosomal et son recyclage depuis les endosomes vers le réseau trans-Golgi et la membrane plasmique. En coordination avec VPS35 et VPS29, VPS26B contribue au maintien de l’homéostasie des protéines membranaires, régule le trafic des récepteurs et soutient la fonction lysosomale en limitant une maturation endosomale aberrante. Les voies dépendantes du rétromère influencent la signalisation cellulaire, la localisation des transporteurs de nutriments et la protéostasie intracellulaire, reliant l’activité de VPS26B à des processus plus larges tels que l’autophagie et les réponses au stress endolysosomal. La dérégulation du trafic endosomal et de la fonction du rétromère a été impliquée dans des phénotypes neurodégénératifs et du développement, faisant de VPS26B une cible pertinente pour des études mécanistiques de la biologie des maladies associées au trafic membranaire.

VPS26B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VPS26B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPS26B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VPS26B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VPS26B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPS26B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VPS26B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPS26B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPS26B dans les cellules tumorales présentant une expression de VPS26B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.