Plásmido CRISPR de Activación (h) versican: sc-401173-ACT

VCAN codifica versicán, un gran proteoglucano de sulfato de condroitina de la matriz extracelular que modula la arquitectura tisular, la hidratación y la señalización pericelular mediante interacciones con el hialuronano, las proteínas de enlace y los factores de crecimiento. La versicán influye en la adhesión, la migración y la proliferación celular al moldear señales mediadas por integrinas y programas de remodelación de la matriz extracelular, con efectos dependientes del contexto sobre la señalización inflamatoria y la comunicación entre estroma y epitelio. La expresión alterada de VCAN y el equilibrio de sus isoformas se han asociado con fibrosis, remodelación vascular y estroma asociado a tumores, donde la composición de la matriz extracelular puede regular la invasión y el tráfico de células inmunitarias. Estas características hacen de VCAN una diana útil para estudiar la regulación del comportamiento celular impulsada por la matriz en el desarrollo, la reparación de heridas y microambientes relevantes para enfermedades.

versican El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VCAN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

versican El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VCAN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VCAN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de versican. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VCAN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de versican en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía versican en células tumorales con expresión de VCAN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.