Plasmide CRISPR d'Activation (h) VAMP-3: sc-402306-ACT

VAMP3 code la protéine de membrane associée aux vésicules 3 (VAMP-3), une v-SNARE qui assure des événements de fusion membranaire nécessaires au recyclage endocytique et à l’exocytose régulée. Elle se localise principalement aux endosomes de recyclage et favorise le trafic de récepteurs et de transporteurs vers la membrane plasmique, en coordonnant des processus tels que la migration cellulaire, le renouvellement des adhésions et la sécrétion de cytokines ou d’enzymes. VAMP-3 participe à l’assemblage des complexes SNARE avec les syntaxines et les protéines SNAP, reliant le transport vésiculaire au remodelage du cytosquelette et aux fonctions des cellules immunitaires. Un trafic vésiculaire dérégulé impliquant VAMP-3 a été associé à une altération de la signalisation inflammatoire, à l’entrée/sortie des agents pathogènes et à des phénotypes métastatiques, ce qui en fait une cible pertinente pour des études sur l’immunité innée, la biologie des infections et l’invasion des cellules cancéreuses.

VAMP-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VAMP3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VAMP-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VAMP3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VAMP3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VAMP-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VAMP3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VAMP-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VAMP-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de VAMP3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.