Plasmide CRISPR d'Activation (h) UGT1A: sc-417594-ACT

UGT1A8 code une UDP‑glucuronosyltransférase humaine de la famille UGT1A qui catalyse la glucuronidation de phase II d’une grande diversité de xénobiotiques et de métabolites endogènes, augmentant leur solubilité dans l’eau afin de favoriser leur élimination biliaire et rénale. Cette activité enzymatique relie UGT1A8 aux réseaux de détoxification hépatiques et extra‑hépatiques, en interaction avec les voies du métabolisme des médicaments et les réponses cellulaires au stress chimique. Des variations ou une expression modifiée au sein des isoformes UGT1A peuvent modifier la capacité de glucuronidation et ont été associées à des différences interindividuelles de clairance des métabolites ainsi qu’à une susceptibilité accrue à la charge en toxiques. UGT1A8 est donc pertinente pour des études mécanistiques de la biochimie de conjugaison, de la régulation des enzymes métaboliques et des effets dépendant du contexte sur l’homéostasie cellulaire.

UGT1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UGT1A8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UGT1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UGT1A8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UGT1A8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UGT1A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UGT1A8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UGT1A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UGT1A dans les cellules tumorales présentant une expression de UGT1A8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.