Plásmido CRISPR de Activación (h) Ubr1: sc-403943-ACT

El UBR1 humano codifica la ligasa E3 de ubiquitina Ubr1, un componente clave de reconocimiento de la vía de la regla del extremo N (N-end rule), que vincula degrones N-terminales con el recambio proteasómico dependiente de ubiquitina. Al controlar la estabilidad de proteínas mal plegadas, dañadas o reguladoras, Ubr1 contribuye al control de calidad de proteínas citosólicas, la adaptación al estrés y redes más amplias de proteostasis que se intersecan con el sistema ubiquitina–proteasoma. La actividad de UBR1 influye en la homeostasis celular mediante la degradación regulada de sustratos, con impacto en la dinámica de señalización y en las respuestas metabólicas. La alteración genética de UBR1 se asocia con fenotipos de enfermedades hereditarias, lo que respalda su relevancia para estudiar mecanismos de fallo de la proteostasis y relaciones genotipo–fenotipo en células humanas.

Ubr1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UBR1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Ubr1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UBR1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UBR1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Ubr1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UBR1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Ubr1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Ubr1 en células tumorales con expresión de UBR1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.