twist CRISPR Activation Plasmid (h): sc-414117-ACT

Humanes **TWIST2** kodiert Twist, einen basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor, der die Festlegung der Zelllinie, die mesenchymale Differenzierung und die Gewebemorphogenese reguliert. Twist verknüpft entwicklungsbiologische Signalwege mit Transkriptionsprogrammen, die Zellidentität, Umbau der extrazellulären Matrix und Prozesse im Zusammenhang mit der epithelial-mesenchymalen Transition steuern. Es moduliert Gennetzwerke, die an der kraniofazialen und Gliedmaßenentwicklung beteiligt sind, und beeinflusst transkriptionelle Zustände von Fibroblasten sowie immunbezogene Programme. Eine Fehlregulation der TWIST2-Aktivität wurde mit angeborenen Entwicklungssyndromen und veränderter Stromabiologie in Verbindung gebracht, was TWIST2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung genregulatorischer Schaltkreise in der Entwicklung und in krankheitsrelevanten Zellmodellen macht.

twist2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TWIST2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

twist2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TWIST2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TWIST2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen twist2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TWIST2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von twist2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des twist2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TWIST2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.