TTI1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404313-ACT

TTI1 (TELO2-interagierendes Protein 1) kodiert eine zentrale Komponente des TTT-Komplexes (TTI1–TTI2–TELO2), eines spezialisierten Co-Chaperons, das die Reifung, Stabilisierung und Assemblierung von Phosphatidylinositol-3-Kinase-verwandten Kinasen (PIKKs) unterstützt. In Kooperation mit HSP90 trägt TTI1 dazu bei, die Proteostase und Signalübertragungskompetenz wichtiger Mitglieder der PIKK-Familie, darunter mTOR, ATM und ATR, aufrechtzuerhalten und beeinflusst damit die DNA-Schadensantwort, den Umgang mit Replikationsstress, die Checkpoint-Kontrolle sowie wachstumsbezogene Signalwege. Störungen der TTI1-abhängigen PIKK-Homöostase können Signalwege der Genomstabilität und stressadaptive Signalnetzwerke verändern. Diese Prozesse sind breit relevant für Mechanismen, die der Krebsbiologie, neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und Erkrankungen mit beeinträchtigter DNA-Reparatur oder gestörter Regulation des mTOR-Signalwegs zugrunde liegen.

TTI1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TTI1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TTI1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TTI1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TTI1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TTI1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TTI1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TTI1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TTI1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TTI1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.