TTC35 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405724-ACT

EMC2 codifica a TTC35, um componente conservado do complexo de proteínas de membrana do retículo endoplasmático (EMC) que contém repetições tetratricopeptídicas. Esse complexo dá suporte à inserção e à maturação de proteínas de membrana multipasso, contribuindo para a proteostase do RE, o tráfego de membranas e as respostas celulares ao estresse. A interrupção de subunidades do EMC pode prejudicar a biogênese de receptores, canais e transportadores, ligando processos regulados por EMC2/TTC35 a alterações na função da via secretória e à sensibilidade ao estresse do RE. Como resultado, EMC2 é frequentemente estudado no contexto de redes de controle de qualidade proteica e de fenótipos relevantes para doenças, impulsionados por defeitos no dobramento ou no tráfego de proteínas de membrana.

TTC35 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EMC2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TTC35 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EMC2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EMC2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TTC35. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EMC2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TTC35 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TTC35 em células tumorais com expressão de EMC2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.