Plasmide CRISPR d'Activation (h) Tropomyosin α: sc-401266-ACT

TPM1 code la tropomyosine alpha humaine, une protéine en coiled-coil se liant à l’actine qui stabilise l’actine filamentaire et régule l’accès de la myosine à l’actine dans les muscles striés et lisses, ainsi que dans les réseaux cytosquelettiques des cellules non musculaires. Grâce à son incorporation spécifique d’isoforme dans les filaments fins, TPM1 contribue à contrôler la contractilité, la forme cellulaire, l’adhérence et la migration, en s’intégrant aux dynamiques actomyosine et aux voies de mécanotransduction. Une expression altérée de TPM1 ou un déséquilibre entre isoformes a été associé à des cardiomyopathies et à des phénotypes de remodelage du cytosquelette pertinents pour la dysfonction musculaire et la motilité des cellules cancéreuses. Ces propriétés font de TPM1 un nœud utile pour étudier l’organisation du sarcomère, l’assemblage des fibres de stress et les réponses de signalisation dépendantes de l’actine.

Tropomyosin α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TPM1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Tropomyosin α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TPM1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TPM1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Tropomyosin α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TPM1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Tropomyosin α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Tropomyosin α dans les cellules tumorales présentant une expression de TPM1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.