Plasmide CRISPR d'Activation (h) Trio: sc-401231-ACT

Le gène humain **TRIO** code Trio, un facteur d’échange de nucléotides guanyliques (GEF) multidomaine de la famille Rho, qui active des GTPases de la famille Rho, dont **RAC1** et **RHOA**, afin de coordonner le remodelage du cytosquelette d’actine, la polarité cellulaire, l’adhésion et la migration dirigée. Par ses fonctions de GEF et de protéine d’échafaudage, Trio intègre des signaux issus des récepteurs à activité tyrosine kinase, des signaux de guidage et des voies dépendantes des intégrines pour façonner la croissance des neurites, le développement des synapses et le trafic vésiculaire. La signalisation dépendante de TRIO module des processus liés aux voies MAPK et PI3K et influence des programmes transcriptionnels en aval de la dynamique du cytosquelette. Une activité de TRIO dérégulée et un contrôle altéré des GTPases Rho ont été impliqués dans des phénotypes neurodéveloppementaux ainsi que dans des comportements cellulaires pertinents pour l’invasion tumorale et le potentiel métastatique, ce qui soutient des études mécanistiques de la motilité et de la formation des circuits neuronaux.

Trio Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TRIO sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Trio Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TRIO dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TRIO, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Trio. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TRIO natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Trio au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Trio dans les cellules tumorales présentant une expression de TRIO silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.