Plásmido CRISPR de Activación (m) TRIM8: sc-429995-ACT

Trim8 codifica TRIM8, una ligasa E3 de ubiquitina de la familia de motivos tripartitos (TRIM) que regula el recambio de proteínas y la salida de señalización mediante mecanismos dependientes de ubiquitina. En células de ratón, se ha implicado a TRIM8 en la modulación de vías inflamatorias y de respuesta al estrés, incluido el diálogo cruzado con la señalización de NF-κB y con reguladores de programas transcripcionales dependientes de p53, influyendo así en el control del ciclo celular y la apoptosis. Al moldear la estabilidad y la actividad de componentes de estas vías, TRIM8 contribuye a un control dependiente del contexto de la señalización inmunitaria innata y de la homeostasis celular. La actividad desregulada de TRIM8 se ha asociado con respuestas inmunitarias alteradas y procesos oncogénicos en modelos experimentales, lo que lo convierte en un nodo útil para interrogar vías y fenotipos.

TRIM8 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Trim8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TRIM8 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Trim8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Trim8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TRIM8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Trim8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TRIM8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TRIM8 en células tumorales con expresión de Trim8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.