Plásmido CRISPR de Activación (m) Triadin: sc-429407-ACT

El gen Trdn de ratón codifica la triadina, una proteína de membrana del retículo sarcoplásmico yuxtajuncional que organiza el acoplamiento excitación–contracción en el músculo estriado al actuar como andamiaje del receptor de rianodina (RyR), la calsecuestrina y otros socios luminales asociados. A través de este complejo de liberación de calcio, la triadina ayuda a regular el almacenamiento de Ca²⁺ en el RS y la cinética de su liberación, conectando la despolarización de membrana con la contracción dependiente de Ca²⁺ y con programas de señalización posteriores sensibles al calcio. Las alteraciones en la función de TRDN perturban la homeostasis de Ca²⁺, desestabilizan el comportamiento del canal del receptor de rianodina y se asocian con fenotipos musculares y cardíacos vinculados a mecanismos arritmogénicos y miopáticos. Por ello, Trdn se estudia ampliamente en vías que gobiernan la arquitectura de las uniones del RS, el manejo del calcio y la fidelidad del acoplamiento excitación–contracción en cardiomiocitos y fibras de músculo esquelético.

Triadin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Trdn sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Triadin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Trdn en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Trdn, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Triadin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Trdn y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Triadin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Triadin en células tumorales con expresión de Trdn silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.