Particules Lentivirales d'Activation (h) TPCN1: sc-404943-LAC

TPCN1 (canal à deux pores segmentaires 1 ; TPC1) code un canal cationique endolysosomal qui médie la libération de Ca²⁺ dépendante de la NAADP à partir d’organites acides, en coordonnant des microdomaines calciques locaux qui façonnent le trafic vésiculaire, la dynamique endosome–lysosome et l’excitabilité membranaire. En couplant les flux ioniques au potentiel de membrane des organites et à une signalisation dépendante du pH, TPCN1 influence des processus tels que l’autophagie, le tri du cargo endocyté et le recyclage des récepteurs. L’activité de TPCN1 s’articule avec des réseaux de signalisation dépendants du calcium et des voies de détection des nutriments qui régulent les réponses au stress cellulaire et le métabolisme. Les dérégulations de l’homéostasie calcique endolysosomale et des programmes de trafic associées à TPCN1 sont étudiées dans des contextes incluant la neurodégénérescence, des phénotypes pigmentaires et métaboliques, ainsi que l’invasion et la migration liées au cancer.

Les particules d'activation lentivirales TPCN1 (h) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de TPCN1 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales TPCN1 (h) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription TPCN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de TPCN1. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif TPCN1 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.