TopBP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402703-ACT

O TOPBP1 humano codifica a TopBP1, uma proteína de scaffolding essencial para a estabilidade do genoma, que coordena o início da replicação do DNA e a resposta ao estresse de replicação dependente de ATR. A TopBP1 promove a ativação de ATR por meio da interação com ATRIP e participa da sinalização de checkpoint, da estabilização de forquilhas de replicação e da escolha de vias de reparo durante a fase S e em resposta a danos no DNA. Por meio de seus domínios BRCT, organiza complexos multiproteicos em forquilhas de replicação estagnadas e na cromatina danificada, integrando o timing de replicação ao controle de checkpoint. A expressão ou função desregulada de TOPBP1 tem sido associada a aumento do estresse de replicação, instabilidade cromossômica e defeitos de manutenção genômica relacionados ao câncer.

TopBP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TOPBP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TopBP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TOPBP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TOPBP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TopBP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TOPBP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TopBP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TopBP1 em células tumorais com expressão de TOPBP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.