Plasmide CRISPR d'Activation (h) TMEM8C: sc-402487-ACT

TMEM8C, également appelé myomaker, code une protéine transmembranaire multipasse essentielle à la fusion des myoblastes lors du développement et de la régénération du muscle squelettique. Il agit au niveau de la membrane plasmique pour favoriser l’activité fusogène et se coordonne avec les réseaux régulateurs myogéniques ainsi qu’avec les processus de remodelage membranaire nécessaires à la formation de myotubes multinucléés. L’expression de TMEM8C est étroitement associée aux programmes de différenciation des cellules musculaires, ce qui en fait un bon point d’entrée pour étudier le contrôle transcriptionnel de la myogenèse et les mécanismes de fusion cellule–cellule. La dérégulation de la fusion des myoblastes et des voies associées à TMEM8C est pertinente dans des modèles expérimentaux de fonte musculaire et dans des myopathies héréditaires, où une altération de la formation ou de la réparation du muscle constitue un phénotype cellulaire clé.

TMEM8C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMEM8C sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TMEM8C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMEM8C dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMEM8C, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TMEM8C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMEM8C natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TMEM8C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TMEM8C dans les cellules tumorales présentant une expression de TMEM8C silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.