Plasmide CRISPR d'Activation (h) TMEFF2: sc-404536-ACT

TMEFF2 (protéine transmembranaire comportant un domaine de type EGF et deux domaines de type follistatine 2) code une protéine transmembranaire de type I impliquée dans la communication cellule–cellule et la signalisation des facteurs de croissance, avec des effets rapportés dépendants du contexte sur la prolifération, la différenciation et la survie cellulaires. Par l’intermédiaire de ses domaines extracellulaires de type EGF et de type follistatine, TMEFF2 a été associée à la modulation de voies liées aux récepteurs à activité tyrosine kinase et à la régulation de programmes transcriptionnels qui façonnent les comportements des lignages épithéliaux et neuronaux. Une expression altérée de TMEFF2 a été observée dans de multiples types de cancers, ce qui étaye son utilité comme point d’entrée moléculaire pour étudier les états de signalisation associés aux tumeurs et la plasticité de lignée. Comme TMEFF2 est localisée à la membrane et à proximité des voies de signalisation, elle est également pertinente pour disséquer la manière dont les signaux extracellulaires sont intégrés en aval en activation de voies et en réseaux de régulation génique.

TMEFF2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMEFF2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TMEFF2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMEFF2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMEFF2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TMEFF2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMEFF2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TMEFF2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TMEFF2 dans les cellules tumorales présentant une expression de TMEFF2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.