Plasmide CRISPR d'Activation (h) TMED2: sc-402765-ACT

TMED2 (transmembrane p24 trafficking protein 2) est une protéine membranaire de type I appartenant à la famille des récepteurs de cargaison p24, qui effectue des cycles entre le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi afin de réguler le bourgeonnement des vésicules, la sélection des cargos et l’homéostasie de la voie sécrétoire. En participant au trafic dépendant de COPI/COPII et au contrôle qualité précoce de la voie sécrétoire, TMED2 influence la maturation et l’acheminement à la surface de multiples protéines membranaires et sécrétées. Des altérations du trafic sécrétoire et de la dynamique de transport RE–Golgi sont fréquemment liées à des réponses au stress de la protéostase et à des modifications de la signalisation cellulaire. La dérégulation de membres de la famille p24, dont TMED2, a été associée dans la littérature à la biologie tumorale et à d’autres affections où une sécrétion aberrante, le trafic des récepteurs et les voies de stress cellulaires contribuent à des phénotypes pertinents pour la maladie.

TMED2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMED2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TMED2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMED2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMED2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TMED2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMED2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TMED2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TMED2 dans les cellules tumorales présentant une expression de TMED2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.