Plasmide CRISPR d'Activation (h) TM: sc-400956-ACT

THBD code la thrombomoduline (TM), une glycoprotéine de surface des cellules endothéliales qui se lie à la thrombine et en modifie la spécificité de substrat afin de favoriser l’activation de la protéine C, établissant ainsi un lien entre le contrôle de la coagulation et la signalisation anti‑inflammatoire. La TM contribue à l’homéostasie vasculaire en modulant les voies des récepteurs activés par protéases (PAR) dépendantes de la thrombine, en limitant la formation de fibrine et en régulant la barrière endothéliale ainsi que les réponses d’adhésion des leucocytes. Une expression ou une fonction altérée de THBD est associée à une hémostase dérégulée et à des phénotypes vasculaires inflammatoires, et le gène est souvent étudié dans des contextes tels que la susceptibilité à la thrombose, la coagulopathie associée au sepsis et la dysfonction endothéliale. En tant que marqueur endothélial sensible à la régulation transcriptionnelle, THBD sert aussi d’indicateur de la contrainte de cisaillement, de l’exposition aux cytokines et des programmes de différenciation vasculaire.

TM Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de THBD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TM Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus THBD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription THBD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus THBD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TM dans les cellules tumorales présentant une expression de THBD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.