Plasmide CRISPR d'Activation (h) TIMP-3: sc-401255-ACT

TIMP3 code pour la TIMP‑3, un inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases lié à la matrice extracellulaire (MEC), qui freine les protéases des familles ADAM et MMP et régule ainsi la protéolyse péricellulaire. En modulant le clivage (shedding) des protéines membranaires et le renouvellement des composants de la matrice, TIMP‑3 influence le remodelage de la MEC, l’adhérence et la migration cellulaires, ainsi que la signalisation inflammatoire, notamment le traitement du TNFα via ADAM17. Des altérations de l’expression ou de l’activité de TIMP‑3 ont été impliquées dans une fibrose dérégulée, le remodelage vasculaire et la dynamique du microenvironnement tumoral, et des variants pathogènes sont associés à des phénotypes de dégénérescence rétinienne tels que la dystrophie du fond d’œil de Sorsby. Ces fonctions font de TIMP‑3 un nœud clé pour étudier l’équilibre protéases–inhibiteurs dans l’homéostasie tissulaire et les voies de remodelage liées aux maladies.

TIMP-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TIMP3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TIMP-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TIMP3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TIMP3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TIMP-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TIMP3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TIMP-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TIMP-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de TIMP3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.