Plasmide CRISPR d'Activation (h) TIMP-1: sc-400408-ACT

TIMP1 code l’inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases-1 (TIMP-1), une glycoprotéine sécrétée qui se lie à plusieurs métalloprotéinases de la matrice (MMP) et les inhibe afin de réguler le renouvellement de la matrice extracellulaire et la protéolyse péricellulaire. En limitant l’activité des MMP, TIMP-1 influence la migration et l’adhérence cellulaires ainsi que le remodelage tissulaire, et s’inscrit dans des réseaux de signalisation qui couplent la dynamique de la matrice aux réponses cellulaires, notamment dans les processus inflammatoires et fibrosants. Une expression dérégulée de TIMP1 est fréquemment étudiée dans des contextes de remodelage anormal de la matrice tels que la fibrose, l’inflammation chronique et la biologie du microenvironnement tumoral, où une homéostasie altérée de la MEC peut affecter des phénotypes associés à l’invasion et à la métastase. En tant que gène lié à l’X et largement exprimé, TIMP1 constitue aussi un marqueur utile pour étudier l’équilibre protéases–antiprotéases dans divers types cellulaires humains.

TIMP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TIMP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TIMP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TIMP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TIMP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TIMP-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TIMP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TIMP-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TIMP-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de TIMP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.