Plasmide CRISPR d'Activation (h) ST: sc-400733-ACT

SLC6A4 code le transporteur de la sérotonine dépendant du sodium et du chlorure (ST, également appelé SERT), un symporteur de la membrane plasmique qui met fin à la signalisation sérotoninergique en recaptant la 5‑hydroxytryptamine depuis l’espace extracellulaire. En régulant la disponibilité de la sérotonine, ST module la neurotransmission, la plasticité synaptique et des réseaux de signalisation en aval liés aux réponses transcriptionnelles dépendantes de l’AMPc/PKA et de la voie MAPK. Outre les cellules neuronales, l’activité de SLC6A4 influence des processus sérotoninergiques périphériques dans les plaquettes et les tissus gastro-intestinaux, qui s’articulent avec des voies neuro-immunes et de réponse au stress. Une expression ou une fonction altérée de SLC6A4 est associée à une susceptibilité à des phénotypes neuropsychiatriques et comportementaux, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de la régulation des circuits sérotoninergiques.

ST Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC6A4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ST Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC6A4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC6A4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ST. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC6A4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ST au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ST dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC6A4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.