Plasmide CRISPR d'Activation (h) SRY: sc-404342-ACT

SRY (sex-determining region Y) code un facteur de transcription à domaine HMG (high-mobility group) qui initie la détermination sexuelle mâle en orientant la différenciation des cellules de Sertoli et le développement des testicules au cours de l’embryogenèse. SRY se lie à l’ADN et le courbe afin de réguler des programmes d’expression génique, en activant notamment SOX9 et en coordonnant les voies de différenciation gonadique en aval qui façonnent le développement de l’appareil reproducteur. Une expression dérégulée de SRY ou des variations de sa séquence sont associées à des troubles du développement sexuel, notamment la dysgénésie gonadique et des phénotypes d’inversion sexuelle, et SRY est également utilisé comme marqueur spécifique de lignée et de sexe dans divers contextes expérimentaux. Parce que SRY agit comme un régulateur maître, la modulation de son activité offre un moyen direct d’explorer les réseaux transcriptionnels qui contrôlent les décisions de destinée cellulaire.

SRY Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SRY sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SRY Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SRY dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SRY, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SRY. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SRY natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SRY au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SRY dans les cellules tumorales présentant une expression de SRY silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.