Plasmide CRISPR d'Activation (h) SRm300: sc-403447-ACT

SRRM2 code pour SRm300, une grande protéine nucléaire riche en sérine/arginine qui sert d’échafaudage au sein du spliceosome et régule les choix d’épissage des pré-ARNm. SRm300 s’associe aux protéines SR et à d’autres facteurs d’épissage dans les speckles nucléaires afin de coordonner la définition des exons, l’épissage alternatif et le couplage entre la transcription et la maturation de l’ARN. Par ces activités, SRRM2 contribue à la diversité des isoformes de transcrits et à la régulation du protéome dans des voies impliquées dans la progression du cycle cellulaire, les réponses aux dommages de l’ADN et la différenciation cellulaire. Des programmes d’épissage dérégulés et une dynamique du spliceosome associée à SRRM2 altérée ont été reliés à des phénotypes pertinents pour la maladie dans des contextes de recherche sur le cancer et les maladies neurodégénératives, où une utilisation aberrante des isoformes peut modifier les sorties de signalisation.

SRm300 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SRRM2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SRm300 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SRRM2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SRRM2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SRm300. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SRRM2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SRm300 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SRm300 dans les cellules tumorales présentant une expression de SRRM2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.