SRC-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400879-ACT

NCOA1 codifica o coativador do recetor de esteroides‑1 (SRC‑1), um coativador transcricional que integra a sinalização dependente de ligando proveniente de recetores nucleares e de outros fatores de transcrição para modular a acessibilidade da cromatina e a expressão génica mediada pela RNA polimerase II. O SRC‑1 recruta histona acetiltransferases e outros corre reguladores para coordenar programas envolvidos na transcrição responsiva a hormonas, na homeostase metabólica, no controlo do ciclo celular e na diferenciação do desenvolvimento. Por meio de interação cruzada com o recetor de estrogénio, o recetor de androgénio, o recetor de glicocorticoides e vias responsivas a fatores de crescimento, o SRC‑1 contribui para uma remodelação transcricional dependente do contexto. Alterações na expressão de NCOA1/SRC‑1 ou na atividade do coativador têm sido associadas à desregulação da sinalização endócrina e das redes transcricionais observadas na biologia de doenças associadas a hormonas, oferecendo um ponto de entrada mecanístico para estudar a regulação génica específica de vias.

SRC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NCOA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SRC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NCOA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NCOA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SRC-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NCOA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SRC-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SRC-1 em células tumorais com expressão de NCOA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.