SorLA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403088-ACT

O SORL1 humano codifica a SorLA, um recetor de triagem com domínio VPS10 que regula o tráfego endossomal e a reciclagem de recetores em neurónios e noutros tipos celulares. A SorLA modula o encaminhamento intracelular da proteína precursora do amiloide (APP) e influencia o processamento amiloidogénico ao direcionar cargas entre a rede trans-Golgi, os endossomas e a superfície celular. Através do seu papel no transporte vesicular e na degradação associada aos lisossomas, a SorLA contribui para a proteostase, a função sináptica e o processamento de recetores lipídicos, ligando a desregulação de SORL1 à genética da doença de Alzheimer e a defeitos endossomais associados à neurodegeneração. Assim, a atividade alterada da SorLA é amplamente estudada em vias que governam o processamento de APP, a maturação de endossomas e a homeostase neuronal.

SorLA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SORL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SorLA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SORL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SORL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SorLA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SORL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SorLA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SorLA em células tumorais com expressão de SORL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.