Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sec61α2: sc-402223-ACT

SEC61A2 code la sous-unité humaine Sec61α2, un composant central du translocon Sec61, qui assure l’import co‑traductionnel des polypeptides naissants dans le réticulum endoplasmique et favorise l’insertion des protéines membranaires. En couplant l’ancrage du ribosome à la translocation vers le RE, Sec61α2 contribue au débit de la voie sécrétoire, à la protéostasie du RE et à la coordination avec la dégradation associée au RE (ERAD) ainsi qu’avec la signalisation de la réponse aux protéines mal repliées (UPR) en situation de stress protéotoxique. Une altération de la fonction du complexe Sec61 peut influencer la maturation des protéines, le contrôle qualité et l’adaptation cellulaire au stress, des processus fréquemment impliqués dans la biologie des maladies prolifératives et métaboliques. SEC61A2 est donc pertinent pour étudier la régulation de la capacité de translocation vers le RE, le remodelage du sécrétome et les voies de réponse au stress en aval.

Sec61α2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SEC61A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sec61α2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SEC61A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SEC61A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sec61α2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SEC61A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sec61α2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sec61α2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SEC61A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.