SAMHD1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424985-ACT

Das murine Samhd1 kodiert SAMHD1, eine dNTP-Triphosphohydrolase, die intrazelluläre Desoxynukleotid-Pools reguliert, um die Genomstabilität während der DNA-Replikation und -Reparatur zu unterstützen. Durch die Modulation der Nukleotidverfügbarkeit greift SAMHD1 in die Signalwege der DNA-Schadensantwort, in Replikationsstress-Pfade sowie in die Zellzykluskontrolle ein und kann zudem die angeborene Immunerkennung beeinflussen, indem es die Verfügbarkeit von Nukleinsäure-Substraten mitbestimmt. In myeloischen und lymphoiden Zelllinien wird SAMHD1 aufgrund seiner Rolle bei der Restriktion retroviraler Replikation und der Kontrolle entzündlicher Signalprogramme untersucht. Eine fehlregulierte SAMHD1-Aktivität wurde in experimentellen Modellen mit aberranten interferonassoziierten Phänotypen, veränderten Antworten auf genotoxischen Stress sowie krankheitsrelevanten immunologischen und hämatologischen Prozessen in Verbindung gebracht.

SAMHD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Samhd1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SAMHD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Samhd1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Samhd1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SAMHD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Samhd1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SAMHD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SAMHD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Samhd1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.