SAMHD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406002-ACT

Humanes SAMHD1 (SAM- und HD-Domänen-enthaltendes Protein 1) ist eine dNTP-Triphosphohydrolase, die die intrazellulären Desoxynukleotid-Pools reguliert und dadurch die Genauigkeit der DNA-Replikation, die Reparaturkapazität und die Genomstabilität beeinflusst. Durch die Steuerung der dNTP-Verfügbarkeit ist SAMHD1 in Replikationsstress-Antworten und Signalwege der DNA-Schadensantwort eingebunden, einschließlich Prozessen, die den Zellzyklusverlauf und die Aufrechterhaltung der Nukleotid-Homöostase prägen. SAMHD1 schränkt zudem die retrovirale Replikation in myeloiden Zellen und ruhenden T-Zellen ein, indem es die für die Reverse Transkription benötigten dNTP-Substrate limitiert, was es mit der angeborenen Immunregulation verknüpft. Eine Dysregulation oder Mutation von SAMHD1 wurde mit entzündlichen und autoimmunen Phänotypen in Verbindung gebracht und im Kontext von Virus–Wirt-Interaktionen sowie krebsassoziiertem Replikationsstress untersucht.

SAMHD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SAMHD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SAMHD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SAMHD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SAMHD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SAMHD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SAMHD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SAMHD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SAMHD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SAMHD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.