Plásmido CRISPR de Activación (h) RPRD1B: sc-412911-ACT

RPRD1B codifica una proteína que interactúa con el CTD, se asocia con la ARN polimerasa II y contribuye a la coordinación de la elongación de la transcripción y del procesamiento de ARN cotranscripcional. Al unirse al dominio C‑terminal fosforilado de POLR2A, RPRD1B ayuda a regular la temporización de la transcripción, la pausa proximal al promotor y los programas de maduración del ARNm que influyen en el control del ciclo celular y en la expresión génica sensible al estrés. La alteración de la expresión o la disrupción regulatoria de moduladores transcripcionales como RPRD1B es relevante para la biología de enfermedades en las que se ven perturbados el equilibrio transcripcional global y las vías de mantenimiento del genoma, incluido el reprogramado transcripcional asociado al cáncer. Por ello, este gen es útil para estudios mecanísticos que vinculan la señalización del CTD de la Pol II con cambios posteriores en el transcriptoma.

RPRD1B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RPRD1B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RPRD1B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RPRD1B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RPRD1B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RPRD1B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RPRD1B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RPRD1B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RPRD1B en células tumorales con expresión de RPRD1B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.