RPGRIP1L Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404458-ACT

RPGRIP1L codifica uma proteína da zona de transição ciliar que atua como plataforma para componentes que interagem com RPGR e ajuda a estabelecer a barreira de difusão que controla o tráfego de proteínas para dentro e para fora do cílio primário. Participa da organização do centrossomo/corpo basal e sustenta as vias de sinalização Hedgehog e outras dependentes de cílios, que coordenam o padrão embrionário e a homeostase tecidual. A disrupção de RPGRIP1L compromete a ciliogênese e a transdução de sinais, associando alterações no “gating” ciliar a fenótipos de desenvolvimento pleiotrópicos. Variações genéticas em RPGRIP1L têm sido associadas a ciliopatias, incluindo distúrbios do espectro de Joubert e Meckel, o que o torna um nó útil para estudar mecanismos de doença mediados por cílios em células humanas.

RPGRIP1L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RPGRIP1L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RPGRIP1L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RPGRIP1L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RPGRIP1L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RPGRIP1L. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RPGRIP1L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RPGRIP1L no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RPGRIP1L em células tumorais com expressão de RPGRIP1L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.