Plasmide CRISPR d'Activation (h) RPE65: sc-401489-ACT

RPE65 code une isomérohydrolase des rétinoïdes essentielle au cycle visuel dans l’épithélium pigmentaire rétinien, en catalysant la conversion des esters de rétinyle tout-trans en 11-cis-rétinol afin de soutenir la régénération de la rhodopsine. Cette activité soutient la phototransduction en maintenant la disponibilité du chromophore et relie le métabolisme des rétinoïdes à des processus cellulaires incluant le transport du rétinol, l’estérification et les réponses au stress oxydant dans la rétine externe. Une expression ou une fonction altérée de RPE65 est associée à un recyclage défectueux du chromophore et à une dysfonction des photorécepteurs, ce qui en fait un nœud clé pour l’étude de l’homéostasie rétinienne. Des modèles in vitro exploitant la modulation de RPE65 sont utilisés pour analyser la régulation transcriptionnelle du cycle visuel et les modifications de signalisation en aval pertinentes pour les phénotypes de dégénérescence rétinienne.

RPE65 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPE65 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RPE65 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPE65 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPE65, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RPE65. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPE65 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RPE65 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RPE65 dans les cellules tumorales présentant une expression de RPE65 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.