RPA 70 kDa subunit CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401454-ACT

RPA1 kodiert die 70‑kDa‑Untereinheit des Replikationsproteins A, eines hochaffinen einzelsträngigen DNA‑Bindefaktors, der freiliegende ssDNA während der Replikation, Rekombination und zahlreicher DNA‑Reparaturreaktionen stabilisiert. RPA1 koordiniert die Rekrutierung und Aktivität zentraler Enzyme der Genomerhaltung und unterstützt Prozesse wie den Schutz der Replikationsgabel, die Nukleotid-Exzisionsreparatur und die homologe Rekombination; zudem ist es während Replikationsstress mit der ATR‑abhängigen DNA‑Schadenssignalgebung verknüpft. Durch die Steuerung der Checkpoint-Aktivierung und der Wahl des Reparaturwegs trägt RPA1 zur Wahrung der genomischen Integrität bei, und eine veränderte RPA1‑Funktion oder ‑Expression wird häufig im Zusammenhang mit Genominstabilitäts-Phänotypen untersucht, die in unterschiedlichen Krankheitsmodellen beobachtet werden.

RPA 70 kDa subunit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RPA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RPA 70 kDa subunit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RPA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RPA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RPA 70 kDa subunit-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RPA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RPA 70 kDa subunit-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RPA 70 kDa subunit-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RPA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.