Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rock-2: sc-400468-ACT

ROCK2 (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2) code Rock-2, une kinase sérine/thréonine qui agit comme effecteur principal de RhoA dans la régulation de la contractilité actine–myosine. Rock-2 phosphoryle des substrats, notamment la chaîne légère de la myosine et les kinases LIM, afin de contrôler la formation des fibres de stress, la dynamique des adhésions focales, la polarité cellulaire et la cytocinèse, façonnant ainsi la migration cellulaire et l’architecture tissulaire. Par ces effets sur le cytosquelette, ROCK2 intègre des signaux provenant de voies liées à la mécanotransduction, au remodelage de la matrice extracellulaire et au tonus endothélial et du muscle lisse. Une signalisation ROCK2 dérégulée a été associée à des modifications du comportement invasif, à des dysfonctions vasculaires, à des réponses inflammatoires et à des processus liés à la fibrose, ce qui en fait une cible fréquemment utilisée pour disséquer des phénotypes pathologiques pilotés par le cytosquelette.

Rock-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ROCK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rock-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ROCK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ROCK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rock-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ROCK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rock-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rock-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ROCK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.