robo2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401916-ACT

ROBO2 codifica o receptor de orientação axonal roundabout 2 (robo2), um receptor transmembranar para ligantes SLIT que regula a orientação de axônios, a migração neuronal e a padronização de tecidos por meio da sinalização SLIT–ROBO conservada. Em células humanas, o ROBO2 influencia a remodelação do citoesqueleto e o movimento celular direcional ao modular a sinalização de GTPases da família Rho e as dinâmicas de adesão a jusante. Para além do neurodesenvolvimento, a atividade de ROBO2 tem sido associada à organização epitelial e à morfogênese por ramificação, sustentando papéis na organogênese e no posicionamento celular. Alterações na expressão de ROBO2 ou a desregulação da via estão associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e têm sido investigadas em contextos que envolvem programas aberrantes de migração e de invasão.

robo2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ROBO2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

robo2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ROBO2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ROBO2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de robo2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ROBO2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de robo2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via robo2 em células tumorais com expressão de ROBO2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.