Plasmide CRISPR d'Activation (h) RICK: sc-400731-ACT

La protéine kinase 2 à sérine/thréonine interagissant avec le récepteur (RIPK2, également appelée RICK) est une kinase de signalisation cytosolique qui joue le rôle d’adaptateur clé en aval des récepteurs de reconnaissance de motifs NOD1 et NOD2. Lorsqu’elle détecte des motifs de peptidoglycane bactérien, RIPK2 médie une signalisation dépendante de l’ubiquitine qui active les voies NF-κB et MAPK, modulant l’expression des gènes inflammatoires, la production de cytokines et la communication de l’immunité innée avec les cellules épithéliales et myéloïdes. RIPK2 est également impliquée dans l’autophagie et la signalisation du stress cellulaire via la régulation des ligases de l’ubiquitine et de cascades de kinases en aval. Une activité dérégulée de la voie RIPK2 a été associée à des phénotypes inflammatoires chroniques et à des pathologies à médiation immunitaire, ce qui en fait un nœud largement étudié dans la recherche sur les interactions hôte–microbe et la signalisation inflammatoire.

RICK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RIPK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RICK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RIPK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RIPK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RICK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RIPK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RICK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RICK dans les cellules tumorales présentant une expression de RIPK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.