REDD-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401797-ACT

O DDIT4 humano codifica a REDD-1, um regulador induzível por estresse que integra sinais de hipóxia, dano ao DNA, estresse do RE e privação de nutrientes para restringir a atividade do mTORC1 por meio da modulação a montante do eixo TSC1/2–Rheb. Ao atenuar programas de crescimento anabólico, a REDD-1 influencia a síntese proteica, a autofagia, o metabolismo mitocondrial e a homeostase redox, moldando a adaptação celular a microambientes flutuantes. Alterações na expressão de DDIT4/REDD-1 têm sido relatadas em contextos caracterizados por estresse metabólico e sinalização de mTOR desregulada, incluindo biologia do câncer, neurodegeneração e estados inflamatórios, nos quais pode impactar a sobrevivência e a tolerância ao estresse. Como um nó responsivo em nível transcricional, a REDD-1 é frequentemente utilizada para investigar o acoplamento entre a sinalização de HIF-1, a detecção de energia dependente de AMPK e os desfechos de crescimento controlados por mTOR.

REDD-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DDIT4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

REDD-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DDIT4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DDIT4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de REDD-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DDIT4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de REDD-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via REDD-1 em células tumorais com expressão de DDIT4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.