Plasmide CRISPR d'Activation (h) RCC1: sc-402078-ACT

RCC1 (regulator of chromosome condensation 1) code un facteur d’échange de nucléotides guanyliques lié à la chromatine, qui génère du Ran-GTP sur les chromosomes, établissant ainsi le gradient de Ran nécessaire à l’assemblage du fuseau mitotique et à la reformation de l’enveloppe nucléaire. En contrôlant le transport nucléocytoplasmique dépendant de Ran, RCC1 coordonne la progression du cycle cellulaire, la condensation des chromosomes et l’organisation nucléaire post-mitotique. La fonction de RCC1 s’articule avec les programmes de réplication de l’ADN et de stabilité du génome via son couplage à la dynamique de la chromatine et au contrôle de la mitose. Une activité ou une expression dérégulée de RCC1 a été associée à des phénotypes prolifératifs et à des réponses de points de contrôle altérées, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des mécanismes soutenant la croissance oncogénique et l’aneuploïdie.

RCC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RCC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RCC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RCC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RCC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RCC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RCC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RCC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RCC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RCC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.