Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ran BP-2: sc-401665-ACT

RANBP2 code Ran BP-2 (NUP358), une grande nucléoporine qui forme les filaments cytoplasmiques du complexe du pore nucléaire et coordonne le transport nucléocytoplasmique dépendant de la GTPase Ran. Ran BP-2 fonctionne également comme une ligase E3 de SUMO, régulant la SUMOylation des facteurs de transport et des protéines mitotiques, et contribue à la progression de la mitose, au fonctionnement du kinétochore et à l’organisation des microtubules. Par ses interactions avec les importines/exportines et les machineries de liaison et de traitement de l’ARN, elle relie le trafic nucléaire au contrôle de l’expression génique et à la protéostasie. La dérégulation des voies de transport et de SUMOylation associées à RANBP2 a été reliée à des phénotypes neuro-inflammatoires et neurodégénératifs, ainsi qu’à des programmes de prolifération altérés dans des contextes cellulaires pertinents pour le cancer.

Ran BP-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RANBP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ran BP-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RANBP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RANBP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ran BP-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RANBP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ran BP-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ran BP-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de RANBP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.